الکتروفورز؛ راهنمای کار با الکتروفورز افقی و عمودی و تفسیر نتایج

الکتروفورز روشی است که معمولا در آزمایشگاه برای جداسازی ملکول های باردار (مثل DNA) بر اساس اندازه، استفاده می شود.

این روش برای جداسازی ملکول های بارداری مانند DNA، RNA، و پروتئین ها کاربرد زیادی دارد.

در تکنیک الکتروفورز، با اعمال یک جریان الکتریکی، ملکول های باردار در داخل ژل به حرکت در می آیند. (جهت مشاهده محصول الکتروفورز کلیک کنید).

اعمال جریان الکتریکی طوری است که یک الکترود ژل به ولتاژ مثبت و به سمت دیگر آن ولتاژ منفی اعمال می شود. این فرآیند توسط دستگاهی به نام پاورساپلای (منبع تغذیه) (جهت مشاهده محصول کلیک کنید) انجام می شود.

حرکت ملکول های باردار مهاجرت نام دارد. مهاجرت ملکول ها همواره به سمت بار مخالف است. برای مثال، ملکولی با بار منفی به سمت الکترود مثبت کشیده و جذب خواهد شد.

مهاجرت ملکول های کوچکتر در داخل ژل سریع تر انجام می گیرد؛ بنابراین مسیر طولانی تری را نسبت به ملکول های بزرگتر طی می کنند.

انواع روش های الکتروفورز

الکتروفورز بر اساس نوع دستگاه مورد استفاده، به الکتروفورز افقی و عمودی تقسیم بندی می شود. این تقسیم بندی را می توان بر اساس نوع محیط پایه نیز انجام داد که به شکل زیر است.

• الکتروفورز ژل آگاروز
• الکتروفورز استات روی
• الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید
• الکتروفورز SDS-PAGE

ژل الکتروفورز و DNA

روش الکتروفورز قادر است که DNA ها را بر اساس طول شان تشخیص دهد. DNA از لحاظ بار الکتریکی، منفی است. بنابراین، زمانی که جریان الکتریکی به ژل اعمال می شود، DNA به سمت الکترود مثبت مهاجرت می کند.

رشته های کوتاهتر سریعتر از رشته های بلند حرکت می کنند. در نهایت بر اساس میزان مسیری که پیموده شده است، طبقه بندی آنها انجام می گیرد.

استفاده از برچسب های فلورنست و یا رادیواکتیو امکان مشاهده رشته ها DNA را بعد از جداسازی فراهم می کنند. نحوه قرارگیری رشته ها مثل نوارهایی جدا از هم است.

همزمان با آزمایش، معمولا یک نشانگر مرجع DNA نیز با طول مشخص، در ژل انجام می گیرد. با مقایسه نوارهای مورد آزمایش با نوارهای نشانگر مرجع می توان مقایسه اصولی بین هردو انجام داد.

نحوه انجام آزمایش الکتروفورز

1.آماده کردن ژل

ژل آگاروز به صورت متداول برای نمایان کردن رشته ها کاربرد زیادی داد. غلظت و میزان آگاروز استفاده شده بستگی زیادی به اندازه رشته هایی مورد آزمایش دارد.

هرچه میزان غلظت آگاروز بیشتر باشد، ماتریس چگال تر است و برعکس. رشته های کوچکتر به آگاروز غلیظ تر و رشته های بزرگتر به آگاروز رقیق تر نیاز دارند.

برای آماده کردن ژل، پودر آگاروز با بافر الکتروفورز مخلوط شده و حرارت داده می شود. فرآیند حرارت دهی تا زمانی انجام می پذیرد که آگاروز کاملا به مایع تبدیل شود.

ژل مایع  به داخل قالب مخصوص ریخته شده و “شانه” در یک طرف دیواره در درون ژل جاگذاری می شود. این شانه به منظور ایجاد چاهک است که در مراحل بعدی نمونه با پیپت درون آن وارد شود.

بعد از اینکه ژل کاملا سفت شد (تبدیل از حالت مایع به ژل جامد)، شانه از داخل ژل بیرون آورده می شود. در این مرحله رنگ ژل نیز از شفافی به تاری نسبی تغییر می کند.

البته می توان از ژل های پیش ساخته نیز استفاده کرد.

در مرحله بعد، ژل در تانک اکتروفورز قرار داده می شود و محلول بافر در داخل آن ریخته می شود تا سطح ژل کاملا پوشیده شود. وظیفه ی بافر رساناسازی برای عبور جریان الکتریکی است. نوع بافر استفاده شده نیز به اندازه تقریبی نمونه DNA مورد آزمایش بستگی دارد.

2. آماده سازی محلول بافر

بافر تریس بورات (Tris-Borate-EDTA) را که TBE نامیده می شود، می توان به صورت زیر تهیه کرد. pH این محلول روی 8 تنظیم می شود. بجای تریس بورات می توان از بافرهای تریس استات و یا تریس فسفات نیز استفاده کرد.

• تریس اسیدی Tris-HCl به میزان 10.8 g
• اسید بوریک Boric Acid به میزان 5.5 g
• ماده EDTA یا همان Ethylendiamino-tetraacetic acid به میزان 0.93 g

3.آماده کردن DNA برای الکتروفورز

قبل از انجام فرآیند الکتروفورز، رنگدانه ای به DNA افزوده می شود تا گرانروی (ویسکوزیته) نمونه افزایش یابد. این عمل باعث می شود تا نمونه در داخل باور شناور نشود و مهاجرت به خوبی در داخل ژل انجام پذیرد.

نشانگر DNA (سایز استاندارد و یا نردبان DNA) در اولین کانال حفره ای (ایجاد شده توسط شانه) بارگذاری می شود. این نمونه حاوی DNA هایی است که مشخص بودن سایز آنها برای آگاهی از نمونه مورد آنالیز کاربرد دارد.

در مرحله بعدی، نمونه های DNA توسط پیپت به بقیه کانال های حفره ای انتقال می بایند. درب اصلی تانک الکتروفورز گذاشته شده و بعد از اطمینان حاصل کردن از اتصال درست الکترودهای مثبت و منفی، الکتروفورز آغاز می شود.

4. جداسازی رشته ها

در این مرحله، با شروع جریان الکتریکی توسط اتصالات منبع تغذیه، DNA های با بار منفی به الکترود طرف مثبت حرکت می کنند. ولتاژ مورد استفاده بین 80 تا 150 ولت و زمان آزمایش در بازه 1 تا 1.5 ساعت به طول می انجامد.

با حرکت آهسته و یا سریع، ملکول ها بر اساس اندازه جداسازی و طبقه بندی می شوند. مهاجرت DNA را درون ژل می توان با بارگذاری رنگدانه ی بافر مشاهده کرد. اتصال جریان الکتریکی تا زمانی ادامه می یابد که از جدایش ملکول ها از هم اطمینان حاصل کرد. ادامه بیش از حد معمول باعث می شود تا ملکول ها خود را به الکترود طرف دیگر رسانده و فرآیند الکتروفورز تخریب شود.

4. نمایش نتایج

زمانی که DNA ها به میزان کافی در داخل ژل حرکت کردند، جریان الکتریکی از پاورساپلای (منبع تغذیه) قطع شده و ژل از داخل تانک بیرون اورده می شود. پس از پایان فرآیند الکتروفورز، ژل را خارج کرده و آنرا در ظرف رنگدانه ای اتیدیوم بروماید به مدت 30 دقیقه قرار می دهیم.

توجه: اتیدیوم بروماید ترکیب موتاژن یا جهش زاست و باید از دستکش استفاده کرد.

برای مانیتور کردن DNA ها، ژل توسط محلول حاوی رنگدانه فلورسنتی آلایش می شود. رنگدانه ها پس از اینکه به خوبی به DNA ها چسبیدند، زیر نور فرابنفش تشعشع می کنند. تشعشع آنها به دلیل وجود ماده فلورسنت در حضور DNA به صورت نوارهایی گسسته دیده می شوند.

از این نوارها و مقایسه آن با نمونه مرجع برای تعیین توالی DNA ها می توان بهره بسیاری جست. تطابق نوارها با نمونه مرجع اطلاعات مفیدی را در رابطه با عملکرد و نوع DNA در اختیار ما می گذارد. در تصویر زیر نوارهای DNA برای نمونه اصلی و مرجع جهت مقایسه نشان داده شده است.   

قیمت دستگاه الکتروفورز

برای مشاوره و اطلاع از قیمت دستگاه های الکتروفورز (افقی و عمودی) و سایر محصولات ساخت فناوران اختریان با شماره 09141161755 تماس حاصل کنید. هرگونه سوال خود را در مورد لیست محصولات و لیست قیمت با ما در میان بگذارید.